科研 | Aging ：注射用小牛血去蛋白提取物缓解阿尔兹海默症的机制研究（国人佳作）

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

阿尔茨海默病(Alzheimer s disease, AD)的特征是认知能力下降，这是由于脑内细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块和神经纤维缠结的积累，损害了谷氨酸(Glu)代谢。小牛血去蛋白提取物注射液(Deproteinized Calf Blood extract Injection, DCBEI)是一种含有17种氨基酸和5种核苷酸的生物药品。在本研究中，我们发现DCBEI预处理通过维持HT22细胞正常线粒体功能来降低L-Glu依赖性神经兴奋毒性。DCBEI也降低促凋亡蛋白表达，增加抗凋亡蛋白表达。DCBEI可减弱B6C3-Tg (APPswePSEN1dE9)/Nju双转基因(APP/PS1)小鼠的AD样行为 (Morris水迷宫试验检测)；这一效应与Aβ和神经纤维缠结沉积的减少以及海马中Tau蛋白的同时减少有关。代谢组学分析显示DCBEI可调节APP/PS1小鼠海马区神经递质水平。非标记蛋白组学研究表明，DCBEI可调控Nrf-2及其下游靶点的表达，以及磷酸化蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶的水平。综上所述，DCBEI可通过上调Nrf-2介导的抗氧化通路，从而预防线粒体凋亡，从而改善AD症状。

论文ID

原名：The neuroprotection of deproteinized calf blood extractives injection against Alzheimer's disease via regulation of Nrf-2 signaling译名：注射用小牛血去蛋白提取物通过调节Nrf-2信号对阿尔茨海默病的神经保护作用
期刊：Aging (Albany NY)IF：4.831发表时间：2021.03通讯作者：王迪、张医芝
通讯作者单位：吉林大学生命科学学院、吉林大学第二医院神经内科

实验设计

实验结果

1. DCBEI成分的检测
我们在DCBEI中鉴定出17种氨基酸，其中含量最多的是苯丙氨酸(15.37g/kg)、组氨酸(10.21 g/kg)和谷氨酸(10.16 g/kg)(表1)。我们检出的5种核苷酸中，次黄嘌呤核苷酸(9.19 mg/100 g)和尿苷酸(9.04 mg/100 g)含量最高(表1)。DBCEI的核糖含量为140.07 mg/kg，分子量分布主要在0-500 kDa之间(93.92%)(表1)。表1 DCBEI的组成
2. DCBEI保护HT22细胞免受线粒体凋亡
L-Glu使HT22细胞活力降低30.1%，而DCBEI使细胞活力提高20%，特别是在浓度为6 mg/mL至8 mg/mL时(p<0.01;图1 a)。与仅用L-Glu处理的细胞相比，DCBEI联合处理的细胞凋亡抑制率为9.5% (p < 0.01，图1B)，caspase-3/7活性降低37.5% (p < 0.01，图1C)，caspase-8活性提高了78.3% (pp < 0.001，图1D)，caspase-9活性提高了64.2% (p p < 0.001，图1E)。4 mg/mL和8 mg/mL浓度的DCBEI均能强烈抑制ROS的积累，红色荧光和绿色荧光强度均降低(图2A-2B)；并且绿色/红色荧光比降低(图2C)，阻止MMP的消散。从报告基因绿色荧光强度的降低可以看出(图2D)，DCBEI还抑制了L- Glu处理的HT22细胞中Ca²⁺内流。此外，DCBEI抑制了L- Glu处理的HT22细胞中促凋亡蛋白Bax、Bid、Bad、cleaved PARP-1、Calpain-1和phospho-Drp1的蛋白水平，并增加了抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL和phospho-RSK1 p90的蛋白水平(图2E)。Aβ1-42诱导U251细胞凋亡，显著降低存活率；而4 mg/mL DCBEI可逆转Aβ1-42诱导的细胞凋亡效应(p <0.01)。与单纯Aβ1-42处理的细胞相比，DCBEI联合处理的细胞凋亡率明显降低(p <0.01，补充图1)。图1 DCBEI保护HT22细胞免受L-Glu诱导的损伤
CBEI (4 mg/mL或8 mg/mL)预孵育HT22细胞3 h，再与L-Glu共同处理24 h。(A) DCBEI提高了细胞活力。(B) DCBEI抑制细胞凋亡。DCBEI可减弱caspase-3/7 (C)、caspase-8 (D)和caspase-9 (E)的活化。 图2 用DCBEI (4 mg/mL或8 mg/mL)预孵育HT22细胞3 h后再与L-Glu共处理24 h
（A） DCBEI降低L-Glu处理的HT22细胞内ROS活性（n=3）。(B）DCBEI减少L-Glu诱导的活性氧生成（n=3）。(C） DCBEI减弱L-Glu诱导线粒体功能障碍（n=3）。(D）Fluo4-AM染色显示DCBEI抑制L-Glu诱导的Ca²⁺增加。(E) DCBEI调控线粒体功能相关蛋白的表达。DCBEI可提高L-Glu处理的HT22细胞抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL和P-RSK1 p90)水平，降低促凋亡蛋白(Bax、Bid、Bad、cleaved PARP-1、Calpain-1和p-Drp1)水平。 3. DCBEI减轻APP/PS1小鼠的AD样症状
在行为学实验中，给予DCBEI 28天可降低APP/PS1小鼠在Morris水迷宫实验中的逃逸潜伏期（图3A），减少小鼠在旷场实验中进入中心区的时间（图3B）。由于Aβ1-42形成淀粉样斑块的核心，它在斑块沉积相关的病理中具有重要的意义。与未处理的APP/PS1小鼠相比，160mg /kg和320 mg/kg DCBEI处理28天，海马Aβ1-42浓度分别降低17.1%和14.8% (p <0.01)(图4)。160mg /kg和320 mg/kg DCBEI血清中Aβ1-42浓度分别增加11.7%和7.4% (p <0.05)(图4 B)。病理分析进一步证实DCBEI依赖的Aβ1-42沉积减少，尤其是海马区(图4C)。与未处理的APP/PS1小鼠相比，DCBEI抑制了海马中p-Tau (p-Tau)的诱导(图4D)，但对总Tau水平没有影响(图4E)。DCBEI显著降低了海马中4-羟基壬烯醛(4- HNE)的水平，4- HNE是氧化应激诱导损伤的关键中介物(图4F)。DCBEI还显著减少了APP/PS1小鼠大脑中TUNEL阳性凋亡神经元的数量(图4G)。DCBEI在脑、脾、肾未引起明显的病理变化(补充图2)，暗示DCBEI可以安全使用。

图3 DCBEI可以改善APP/PS1小鼠的行为性能

(A)与未处理的APP/PS1小鼠相比，DCBEI 28天的治疗过程减少了Morris水迷宫试验中的逃避潜伏期。(B)减少了小鼠在开阔场地试验中进入中心区域的时间。

图4 DCBEI减轻APP/PS1小鼠脑组织病理学改变

（A）DCBEI降低海马组织中Aβ1-42的表达（n=10）和（B）增加血清中Aβ1-42的表达（n=10）。(C）DCBEI降低了海马体Aβ的水平（n=3）。(D）DCBEI减弱了海马中p-Tau水平的增加（n=3），（E）但不影响总Tau水平（n=3）。(F）DCBEI显著降低APP/PS1小鼠（n=3）大脑中4-HNE的水平。(G）TUNEL染色显示DCBEI治疗28天显著减少细胞凋亡。

4. DCBE对APP/PS1小鼠神经递质的调节
我们采用HPLC-MS/MS法对9种神经递质（包括r-氨基丁酸（GABA）、去甲肾上腺素（NA）、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、5-羟色胺（5-HT）、组胺（HIS）、谷氨酰胺（Gln）和盐酸异丙肾上腺素（iso Hyd））的血清含量进行定量（图5C和补充图3）。在此基础上，我们用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了全脑组织中7种神经递质的含量。与未处理的APP/PS1小鼠相比，DCBEI处理的小鼠（160 mg/kg和320 mg/kg）的GABA（p<0.01）、异羟色胺（p<0.001）、5-HT（p<0.01）、NA（p<0.001）、HIS（p<0.001）和5-HIAA（p<0.01）水平分别提高了71.4%、>73.9%、>63.9%、>59.3%、>79.0%和>96.6%（表2）。表2 DCBEI对APP/PS1小鼠海马神经递质的影响 5. DCBEI对核因子-红细胞2相关因子2 (Nrf-2)信号转导的调控
蛋白质组学显示在WT和APP/PS1小鼠之间差异表达了362种蛋白质，在DCBEI处理和未处理的APP/PS1小鼠之间差异表达了309种蛋白质（补充图4）。在应用A/B>1.5或A/B<0.66的临界值后，我们观察到在DCBEI处理后有64种蛋白质表达差异（32种上调，32种下调；图5A）。基因本体（GO）分析显示线粒体蛋白质的富集，表明DCBEI介导的神经保护与细胞凋亡和氧化应激的调节有关（补充图5）。接下来我们用STRINGdb分析了实验组间差异表达的蛋白质之间的相互作用；这揭示了333个富集相互作用和165个潜在相互作用（图5B）。液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析显示APP/PS1小鼠血清和海马中抗氧化因子和促氧化因子水平的变化。与对照组相比，DCBE处理小鼠血清和海马过氧化氢酶（CAT，p<0.05）浓度升高，ROS水平降低（p<0.05），海马谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，p<0.05）和超氧化物歧化酶（SOD，p<0.05）水平升高，血清丙二醛（MDA，p<0.05）水平降低（表3）。在DCBEI最高剂量（320 mg/kg）时，效果尤其显著。在L-Glu处理后，Nrf-2及其下游靶点（包括HO-1、SOD-1、SOD-2、GCLC、GCLM和NQO1）下调，而C-Maf和PKC上调。用DCBEI预孵育3小时可逆转这些效应（图6A）。与仅用L-Glu处理的细胞相比，DCBE预处理的细胞显示AKT和mTOR的磷酸化增强，JNK、PTEN和P38的磷酸化降低（图6B）。此外，DCBEI增加了L-Glu处理的HT22细胞的核细胞C水平以及Nrf-2和磷酸化ERK的核易位（图6C）。

图5 DCBEI对APP/PS1小鼠作用的蛋白质组学和代谢组学分析

(A）差异表达因子热图（n=3）。(B）通过STRINGdb处理的蛋白质之间的关系。(C）使用HPLC-MS/MS对血清神经递质水平进行定量。结果观察到9种神经递质（R-氨基丁酸、去甲肾上腺素、5-HIAA、5-羟色胺、甲氧基酪胺、组胺、酪胺、谷氨酰胺和正常甲肾上腺素）的水平存在显著差异（n=3）。

图6 DCBEI通过减少细胞凋亡、减轻氧化应激和通过Nrf2信号调节神经递质水平来改善AD症状

(A）在L-Glu暴露的HT22细胞中，DCBEI增加了Nrf-2及其下游靶点HO-1、SOD-1、SOD-2、GCLC、GCLM和NQO1的表达，并降低了C-Maf的表达水平。(B）L-GLu处理的HT22细胞中MAPK和Akt的分析。DCBEI增加L-Glu处理的HT22细胞中p-AKT和p-mTOR的表达，降低p-JNK、p-PTEN和p-P38的表达。(C）DCBEI增加p-ERK水平，引起p-ERK、Nrf-2和cytoc从细胞质向细胞核的重新分布。

表3 DCBEI对APP/PS1小鼠血清和海马氧化应激相关因子水平的影响

讨论

DCBE是从新鲜小牛血液中经脱蛋白、超滤、浓缩而成，已在中国临床上使用多年（SFDA批准号H20060121）。在本研究中，我们发现DCBEI含有17种氨基酸，5个核苷酸和丰富的核糖，这证实了它的高营养含量。DCBEI的多种成分不仅解释了它在大多数实验中的非剂量依赖性效应，而且表明它是安全的。我们的病理检查也证实了后一点。当大脑缺氧或缺血时，释放大量的谷氨酸，进而引发细胞内Ca²⁺的动员，使神经元持续兴奋。在AD中，谷氨酸过度刺激引起的兴奋性毒性是神经元坏死和凋亡发生之前的最终步骤。AD病理的发生进一步降低了神经细胞吸收Glu的能力，因为它导致Glu转运体（兴奋性氨基酸转运体）的表达减少；这种恶性循环加剧了兴奋毒性。我们的数据表明，在HT22细胞中DCBEI有效地减弱了这一过程。在神经退行性疾病中，线粒体损伤增加是葡萄糖诱导的神经毒性的主要特征。线粒体损伤导致氧化还原受损、ATP合成减少和细胞凋亡增加；过量的L-Glu刺激突触后Glu受体，导致Ca²⁺通过N -甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体通道内流，进而激活线粒体通透性转变孔的打开。孔道开放引发活性氧(ROS)等活性代谢物的过量产生，通过调节ATP敏感的钾通道，进一步扰乱线粒体功能和线粒体膜电位(MMP)的障碍。已知磷酸化RSK1-p90可抑制ROS活性，从而抑制氧化应激；而促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成员分别通过激活或抑制线粒体内通透性转换通道来调节线粒体膜的通透性。兴奋毒性刺激也会导致Ca²⁺的释放，这可以激活Calpain-1（一种在线粒体内起作用的促凋亡因子）。Drp1的磷酸化与线粒体碎片有关，是细胞凋亡的早期标志。过量的ROS激活JNK和P38激酶，这是促凋亡信号转导的中介；这些激酶触发Bax积累，从而使细胞对凋亡敏感。同时，ROS通过促进PTEN的磷酸酶活性抑制AKT的激活，导致线粒体生物合成受损。AKT的活性可以稳定Nrf-2（一种上调抗氧化基因的转录因子），从而促进正常的线粒体功能。我们发现DCBEI预处理通过抑制氧化应激促进线粒体功能，这与抗氧化剂在抑制神经毒性中的关键作用一致。由于APP/PS1双转基因小鼠存在明显的学习记忆功能障碍和Aβ积累增加，这种品系已广泛应用于AD病理生理学研究。严格控制Glu运输的血脑屏障在AD患者中受损，导致大脑Glu浓度增加。氧化应激的发生与Aβ斑块的沉积有关，氧化应激在AD发病过程中起关键作用，发生在AD发病的早期。高水平的Aβ1-40和Aβ1-42与AD患者海马区高水平的氧化产物相关，Aβ和ROS在反馈回路中协同，导致线粒体功能障碍和凋亡。此外，Aβ的过度沉积导致Tau蛋白的沉积，进而形成记忆缺陷和突触变性的神经原纤维缠结（NFT）。值得注意的是，我们的体外实验发现DCBEI可以抑制Aβ1-42诱导的细胞凋亡。显然，DCBEI在APP/PS1小鼠中具有神经保护作用，因为它抑制了海马中Aβ和Tau的沉积；这反过来又降低了这些动物类AD行为的严重程度。高水平的氧化应激生物标志物4-HNE存在于高Aβ沉积的海马区域。ROS和MDA的积累会破坏SOD和GSH-Px的活性，SOD和GSH-Px是促进清除氧自由基的内源性抗氧化剂，而CAT是关键的ROS缓冲剂。在AD海马体中观察到的Nrf-2活性降低可能解释了该脑室中重要的抗氧化酶(如SOD和GSH-Px)的下调。AD组织中氧化应激的增加导致Aβ和P-Tau异常积累，从而形成一个恶性循环。DCBEI治疗后，APP/PS1小鼠大脑中4-HNE水平下降，同时ROS水平下降，这意味着海马神经元凋亡数量的减少。海马神经发生过程中神经递质的相互作用会影响个体的情绪和行为，并可能导致神经退行性疾病的发生。神经元对谷氨酰胺的吸收激活了谷氨酰胺循环，这与抑制性神经递质GABA的水平密切相关。事实上，在一些AD患者中观察到的神经元过度兴奋可能是由于GABA水平极低。5-HT的活性受Glu、GABA等其他神经递质的直接或间接调节，对短期和长期记忆有影响；这两种认知功能在AD患者中都受到强烈抑制。NA可通过降低Aβ1-42细胞毒性，改善AD患者的认知功能和减轻焦虑。HIS的增加与大脑皮层中乙酰胆碱(Ach)的释放有关，而乙酰胆碱反过来与实验动物增强的记忆和学习能力有关。与这一发现相一致的是，有证据表明AD患者大脑中HIS减少。AD患者胆碱能功能减弱与记忆功能受损和认知能力下降相关。此外，一些神经递质(包括HIS)可以通过增强ROS的释放来刺激氧化应激。ROS触发的氧化应激激活JNK和P38。相比之下，活化的Nrf-2信号可以减少氧化应激，从而减轻淀粉样蛋白病理引起的认知障碍。与核Nrf-2在调节淀粉样蛋白诱导的病理过程中的作用一致，其在AD小鼠海马中的水平较低。在L-Glu处理的HT22细胞中，DCBEI通过促进Nrf-2的核转位来刺激其生物活性。Nrf-2是Akt和mTOR的正调控因子，共同负调控PTEN，保护线粒体，提高细胞存活率。根据先前的研究，一些神经递质的神经保护作用是具有Nrf -2依赖性。目前的研究有一个局限性。虽然DCBEI已被SFDA批准在中国临床使用，但我们无法确定该生物制药的神经保护作用的具体成分。

结论

总之，DCBEI通过促进Nrf-2依赖的抗氧化反应缓解AD症状，进而防止线粒体凋亡。本研究结果为DCBEI辅助治疗AD提供了实验支持。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33819182/

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